Учёные из МФТИ и ОИЯИ в совместной работе увеличили точность обнаружения ценных кристаллов белков, размер которых ограничен парой микрон. Именно такие маленькие кристаллы используются сейчас для изучения структуры мембранных белков, знание которой очень важно для фундаментальных и прикладных фармацевтических исследований. Работа опубликована в престижном журнале Journal of American Chemical Society.

Белки: молекулярные машины, ценные для фармацевтов.

Белки — важные молекулярные машины, которые выполняют большинство функций в организме человека. Особо среди них выделяются мембранные белки, «сидящие» на мембране каждой клетки в нашем теле: они переносят вещества, энергию и сигналы непосредственно внутрь клеток, позволяя им «общаться». Мембранные белки-рецепторы — самые популярные мишени для лекарств. На них действуют, по разным оценкам, до 60% современных препаратов — например, називин или плавикс (лекарство от инсульта). Активируя или деактивируя рецепторы, правильно подобранные препараты могут регулировать физиологические процессы, которые были нарушены во время болезни.

Знание структуры белка во много раз удешевляет и ускоряет поиск лекарств. Подробную структуру получают методом рентгеновской дифракции, для которого необходимо вырастить большой однородный кристалл белка. Рассеяние рентгеновских лучей на кристаллической решётке и даёт затем структуру. Получить кристалл мембранного белка очень сложно. Особенно сложно это для важнейших рецепторных белков класса GPCR — в 2012 году за исследование их структуры была дана Нобелевская премия.

В настоящее время для изучения мембранных белков применяют рентгеновские лазеры на свободных электронах — сверхсовременные источники жёсткого рентгеновского излучения. Их мощности достаточно, чтобы использовать совсем небольшие кристаллы. Проблема в том, что при росте таких кристаллов сложно понять, какого качества они выросли и выросли ли вообще. Для предварительной проверки качества в настоящее время применяется техника SONICC, основанная на наложении изображений от метода SHG (который способен «видеть» упорядоченные кристаллы сквозь неупорядоченную среду, в которой они растут) и UV-TPEF (особый вид микроскопии, который может видеть только специальные аминокислоты, которые входят в состав молекулы белка). Точности этого метода, однако, зачастую оказывается недостаточно для детекции кристаллов размером около микрона. Учёным из МФТИ и ОИЯИ удалось превзойти метод SONICC (точнее, его принципиального компонента SHG), показав при этом чувствительность к тонким особенностям структуры белка, имеющим чрезвычайно важное значение при дальнейшем исследовании.

CARS: поиск микронных кристаллов с увеличенной точностью

Для исследования кристаллов учёные применили метод P-CARS — особый вид спектроскопии. Он использует нелинейный оптический эффект и применяется, например, для визуализации с высоким разрешением процессов, происходящих в клетках. Для применения метода требуется два лазера, лучи которых скрещивают на образце с белковым кристаллом (рис. 1). Полученный сигнал фильтруется оптической системой, позволяя отличить области с белковым кристаллом от небелкового окружения. Сканируя отдельные точки образца по очереди, исследователи получают трёхмерную картинку кристалла.

«Научному сообществу широко известна CARS-микроскопия, применяемая в основном для визуализации процессов, происходящих в клетке. Метод CARS также можно настроить для того, чтобы детектировать специфичные только для белков химические связи, получая возможность видеть «сквозь» среду, в которой растут кристаллы. Мы использовали метод на модельных белках бактериородопсине (мембранный белок) и лизоциме (водорастворимый белок)», — пояснил нам Алексей Власов, сотрудник Лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ.

Оказалось, что в случае кристаллов бактериородопсина можно заранее заметить распространённый дефект кристалла, так называемое двойникование, что невозможно при использовании SHG — принципиального компонента метода SONICC (который «видит» упорядоченные кристаллы, не различая их состав). Двойникование часто не позволяет узнать структуру белка с достаточной точностью, усложняя поиск лекарств, однако заметить этот дефект для микроскопических кристаллов до сих пор можно было только после проведения затратных рентгеновских исследований. Метод CARS позволяет обнаружить его.

На примере кристаллов лизоцима учёные показали значимое преимущество метода CARS, продемонстрировав, что в некоторых случаях он может видеть кристаллы, которые не может заметить SONICC.

Изображение предоставлено авторами статьи.

Перспективы: оборудование нового поколения

Исследователи применили известный метод CARS к обнаружению белковых кристаллов и показали, что он по точности и чувствительности к важным дефектам кристаллов превосходит используемый в настоящее время SONICC. Учитывая, что CARS не превосходит SONICC по стоимости и сложности, можно ожидать его появление в коммерческих установках для кристаллизации следующего поколения. Более того, полученные фундаментальные результаты повысят качество кристаллизации мембранных белков, важных для фармакологии, ускорив появление новых лекарств с минимальными побочными эффектами и повышенной эффективностью.