Исследователи из МФТИ опубликовали в журнале Expert Opinion on Drug Discovery обзор одного из самых перспективных современных методов для анализа третичных структур белков — серийной фемтосекундной кристаллографии. Этот получивший мощное развитие в последние 10 лет подход открыл новые перспективы в рациональной разработке лекарств к ранее недоступным для анализа белковым мишеням.

Рентгеновская кристаллография

Рентгеновская кристаллография или иначе рентгеноструктурный анализ — один из главных методов определения трехмерной структуры биологических макромолекул, таких, например, как белки. Благодаря этому методу получены структуры множества важных для фармакологии ферментов и рецепторов, что позволило разработать лекарственные молекулы, влияющие на эти белки.

Метод рентгеновской кристаллографии заключается в том, что предварительно выделенный и очищенный белок кристаллизуют — постепенно высушивают растворитель, что приводит к формированию кристаллов белка — его молекулы начинают складываться в регулярную структуру. Полученный таким образом кристалл помещают в специальное устройство, где облучают рентгеновским излучением. По картине дифракции математики и физики могут установить, какой атом в какой позиции кристалла находится, и тем самым установить трехмерную структуру формирующей кристалл единицы — белковой молекулы.

До разработки этого метода поиск лекарственных молекул был по большей части эмпирическим: исследователи либо пытались менять структуру известных молекул, влияющих на данный белок, либо просто перебирали массу молекул из различных химических библиотек, пытаясь подобрать новое лекарство. Доступ к трехмерным структурам белков оказался очень востребованным — теперь исследователи могут сидя за компьютером видеть устройство молекулы, на которую надо воздействовать, и перебирать миллионы вариантов потенциальных лекарств за короткое время, и тратить намного меньше времени и денег на химический синтез и «мокрые» эксперименты.

Рентгеноструктурный анализ дает хорошие результаты, если кристалл максимально большой, стабильный и однородный (то есть не содержащий примесей или искажений структуры). Для лучшего детектирования слабого сигнала дифракции нужен также интенсивный поток излучения. Но слишком мощный импульс может разрушить кристалл. Классический рентгеноструктурный анализ заключается в постепенном поворачивании в разные стороны кристалла белка в луче рентгеновского излучения с целью получения дифракционных картин в разных ориентациях и, как следствие, — максимального количества информации о структуре.

Метод для трудных мишеней
Почти сразу после изобретения рентгеновской кристаллографии стало ясно, что не все биологические макромолекулы удастся кристаллизовать. Довольно легко можно было получить раствор белков, которые и без того были растворены во внутренней среде клетки. Если такой раствор особым образом выпарить, часто можно получить большой и регулярный кристалл. Но вот мембранные белки, например многие рецепторы, не позволяют создать достаточно большие и чистые кристаллы для классической кристаллографии. Современные методы кристаллизации позволяют получить для таких белков лишь небольшие кристаллы, зачастую непригодные для классической кристаллографии. Причем эти белки часто являются очень важными звеньями патогенеза различных заболеваний и знание их структуры крайне важно для фармаколога-исследователя.

Менее 10 лет назад наконец было предложено решение для таких белков. Его назвали серийной фемтосекундной рентгеновской кристаллографией, или SFX. В основе SFX лежат изобретенные незадолго до этого рентгеновские лазеры на свободных электронах (рисунок 1).

Алексей Мишин, заместитель руководителя лаборатории структурной биологии рецепторов МФТИ, один из авторов статьи, поясняет: «Главной прорывной особенностью этой технологии стала крайне высокая плотность энергии лазерного импульса. Объект подвергается столь мощному излучению, что неминуемо и почти мгновенно разрушается. Однако до его разрушения отдельные кванты лазерного импульса успевают рассеяться и попасть на детектор, что дает исследователям материалы для исследования структуры исходного белка. Эту особенность разработчики технологии назвали „diffraction before destruction“, или „дифракция перед разрушением“».

Рентгеновские лазеры на свободных электронах оказались полезны не только в биологии: они также активно используются химиками и физиками. Использование SFX в последние годы набирает обороты. Первая установка была открыта для свободного использования экспериментаторами в 2009 году и с тех пор по всему миру насчитывается уже пять открытых для исследователей центров — в США, Японии, Южной Корее, Германии и Швейцарии. Заканчивает строительство своего центра Китай, а США анонсировали модернизацию своего (исторически самого первого) комплекса.

Хотя новая технология позволила исследователям взглянуть на белки, ранее не поддававшиеся анализу, она также потребовала разработки множества дополнительных технических и математических решений. Классическая рентгеновская кристаллография подразумевает облучение одного кристалла с разных сторон и совместный анализ картин рассеяния. При SFX кристалл разрушается сразу, при первом взаимодействии с мощным рентгеновским импульсом. В результате исследователям необходимо последовательно облучать множество мелких кристаллов и анализировать целую серию картин дифракции (именно поэтому технология получила название «серийной»).

Кроме того, возникла проблема отбора образцов. При классической кристаллографии исследователь просто выбирал самый качественный кристалл максимально большого размера. Это можно было делать вручную и «на глазок». Тут же мы имеем дело с суспензией мелких кристаллов разного размера и качества. Разработаны методы отделения кристаллов нужного размера при помощи центрифугирования или с использованием сит с известным размером пор.

Также пришлось разработать особые методики подачи образца в камеру. Рентгеновские лазеры на свободных электронах обладают определенной максимальной частотой, с которой они могут излучать импульсы рентгеновского света. Для оптимизации работы по времени и затратам, необходимо подавать новый кристалл в рабочую камеру с такой же частотой. В настоящий момент разработано два принципиально разных подхода к решению этой задачи. В первом случае кристаллы попадают в камеру в виде жидкой суспензии, подаваемой через инжектор. Получающуюся на выходе из инжектора струю жидкости «обжимают» с помощью потока газа так, чтобы кристалл при пролете через лазерный луч оказался строго в его центре (рисунок 2, слева). Во втором случае кристаллы белка распределяют по прозрачной для рентгена подложке и автоматически подставляют следующий кристалл лазерному лучу перед импульсом (рисунок 2, справа).

Первые результаты данная технология дала уже в 2011 году, и с тех пор более 200 новых расшифровок структур для различных белков стало доступно исследователям. Среди них — 51 потенциально важная для фармакологии мишень (мембранные рецепторы, ферменты, вирусные белки и т. д.), ранее не поддававшаяся классическим методам анализа.

Систематизация известных на данный момент особенностей технологии в приложении к биологии и фармакологии, проведенная исследователями из МФТИ, несомненно будет полезна для ученых, занимающихся разработкой лекарств и нуждающихся в получении структур важных фармакологических мишеней.